Stfw.Ru
Птицы, хорьки и мораторийВ 2011 году две исследовательские группы под руководством Рона Фуше (Ron Fouchier) и Йошихиро Каваока (Yoshihiro Kawaoka) заявили, что им удалось модифицировать вирус птичьего гриппа H5N1. Если исходный штамм может передаваться к млекопитающему только от птицы, то модифицированный мог передаваться и среди млекопитающих, а именно хорьков. Эти животные были выбраны в качестве модельных организмов потому, что их реакция на вирус гриппа наиболее близка человеческой.Статьи с результатами исследования и описанием методов работы были отправлены в журналы Science и Nature - но не были опубликованы. Публикация была остановлена по требованию Национальной научной комиссии по биобезопасности США, посчитавшей, что технология модификации вируса может попасть в руки террористов.Идея облегчить опасному вирусу, от которого умирает 60 процентов заболевших птиц, распространение среди млекопитающих вызвала бурные обсуждения и в научном сообществе. Дело в том, что вирусу, научившемуся распространяться в хорьках, гораздо проще научиться распространяться в людях в случае "побега" из лаборатории.Итогом дискуссии стал добровольный 60-месячный мораторий на исследования по этой тематике, отмененный в 2013 году, после принятия новых регулирующих норм.Работы Фуше и Каваоки в конце концов были опубликованы (правда, из статей убрали некоторые ключевые детали), и они наглядно продемонстрировали, что для перехода к распространению между млекопитающими вирусу надо очень мало и риск появления такого штамма в природе велик.В 2014 году, после нескольких инцидентов в американских лабораториях, министерство здравоохранения США полностью остановило проекты, связанные с исследованиями трех опасных патогенов: вируса гриппа H5N1, MERS и SARS. Тем не менее, в 2019 году ученым удалось договориться о том, что часть работ по изучению птичьего гриппа будет все-таки продолжена с усиленными мерами безопасности.Такие предосторожности не безосновательны, - известны случаи, когда вирусы "сбегали" из гражданских лабораторий. Так, спустя несколько месяцев после окончания эпидемии SARS-CoV в 2003 году пневмонией заболели два студента Национального Института вирусологии в Пекине и еще семь связанных с ними человек. Лабораторию института, занимавшуюся исследованиями SARS, немедленно закрыли, а всех пострадавших изолировали, так что заболевание не распространилось дальше.
Катастрофа в пробиркеЗачем обычные гражданские ученые, не военные и не террористы, рискуют жизнью миллионов человек, создавая потенциально опасные штаммы вирусов? Почему нельзя ограничиться исследованием уже существующих вирусов, тоже доставляющих немало проблем?Если коротко, ученые хотят овладеть методом предсказания, как именно может произойти катастрофа, и заранее найти способ ее остановить или хотя бы снизить ущерб.Появление смертельно опасного и легко распространяющегося вируса с неизученным поведением представляет угрозу для людей. Если ученые и медики понимают, как именно происходит трансформация потенциального патогена и заранее знают его основные свойства, противостоять новой напасти - или предотвратить ее - становится значительно легче.Многие крупные эпидемии последних лет были связаны с тем, что вирус, распространенный среди животных, в результате эволюции приобретал способность заражать людей и передаваться от человека к человеку.Предыдущие эпидемии птичьего гриппа и синдромов SARS и MERS были спровоцированы контактами людей с животными - хозяевами вирусов: птицами, циветами, одногорбыми верблюдами. Несмотря на то, что эпидемии удавалось остановить и вирус исчезал из популяции людей, он всегда оставался в природном резервуаре и в любой момент мог снова "перепрыгнуть" на человека.Ученые продемонстрировали, что вирус, провоцирующий MERS, "перепрыгивал" со своего основного хозяина - одногорбого верблюда - на человека не один раз, так что каждая вспышка заболевания была связана с отдельным переходом и спровоцирована независимыми мутациями вируса.После эпидемии атипичной пневмонии 2003 года, вызванной вирусом SARS-CoV, вышло много статей (например, раз, два и три), основной посыл которых сводился к тому, что в природе существует постоянный "резервуар" вирусов, похожих на SARS-CoV. Их хозяева, в основном, - летучие мыши, и вероятность "перепрыгивания" вируса с них на людей высока, так что стоит быть готовым к новой эпидемии, говорилось в обзоре, опубликованном еще в 2007 году.В этом переходе большую роль играют промежуточные хозяева, в которых вирус может пройти необходимую адаптацию. В случае эпидемии 2003 года эту роль сыграли циветы. Сперва вирус летучих мышей жил в них, не вызывая симптомов, и только потом - пройдя адаптацию - перескочил к людям.Это был не единственный потенциально опасный штамм: в 2007 году в окрестностях того же Уханя исследователи обнаружили цивет - носителей сестринского для штамма SARS-CoV вируса, который на проверку очень плохо, но мог связываться с рецепторами человеческих клеток.В 2013 году у летучих мышей - подковоносов был обнаружен коронавирус, способный использовать для попадания в клетки не только их собственные рецепторы ACE2, но и рецепторы цивет и людей. Это поставило под сомнение необходимость промежуточного хозяина.Позже, в 2018 году, исследователи из Института Вирусологии Уханя показали, что иммунная система некоторых людей, проживающих неподалеку от пещер, где обитают летучие мыши, уже знакома с SARS-подобными вирусами. Процент таких людей оказался невелик, но это ясно указывает: вирусы регулярно "проверяют" возможность заселиться в человека, и иногда им это удается.Чтобы спрогнозировать угрозу, исходящую от потенциального патогена, требуется понимать, как именно он может измениться и каких изменений ему достаточно для того, чтобы стать опасным. Часто для этого недостаточно математических моделей или исследований уже прошедшей эпидемии, необходимы эксперименты.
Коронавирус-химераИменно для того, чтобы понять, насколько опасны циркулирующие в популяции летучих мышей вирусы, в 2015 году при участии той же лаборатории в Ухане был изготовлен вирус-химера, собранный из частей двух вирусов: лабораторного аналога SARS-CoV и вируса SL-SHC014, распространенного в подковоносах.Вирус SARS-CoV тоже пришел к нам от летучих мышей, но с промежуточной "пересадкой" в цивете. Исследователи хотели узнать, насколько пересадка была необходима, и определить патогенный потенциал родственников SARS-CoV, живущих в летучих мышах.Важнейшую роль в том, сможет ли вирус заражать того или иного хозяина, играет S-белок, получивший свое название от английского слова spike ("шип"). Этот белок - главный инструмент вирусной агрессии, он цепляется за рецепторы ACE2 на поверхности клеток хозяина и обеспечивает проникновение в клетку.Последовательности этих белков у разных коронавирусов довольно разнообразны и "подогнаны" в ходе эволюции под контакт с рецепторами своего конкретного хозяина.Так, последовательности S-белков у SARS-CoV и SL-SHC014 отличаются в ключевых местах, поэтому исследователи хотели разобраться, мешает ли это вирусу SL-SHC014 перекинуться на человека. Ученые взяли S-белок SL-SHC014 и встроили его в модельный вирус, на котором изучают SARS-CoV в лаборатории.Выяснилось, что новый синтетический вирус не уступает исходному. Он мог заражать лабораторных мышей, а заодно проникать в клетки человеческих клеточных линий. Это значит, что вирусы, обитающие в летучих мышах, уже несут в себе "детали", которые могут помочь им перекинуться на человека.Дополнительно исследователи проверили, может ли вакцинация лабораторных мышей при помощи SARS-CoV уберечь их от гибридного вируса. Оказалось, что нет, так что даже люди, переболевшие SARS-CoV, могут оказаться беззащитны перед потенциальной эпидемией и старые вакцины не помогут.Поэтому в своих выводах авторы статьи подчеркнули необходимость разработки новых лекарств, а позже приняли в этом непосредственное участие.Аналогичный этому обратный эксперимент - пересадка участка S-белка SARS-CoV вирусу летучих мышей Bat-SCoV - была проведена еще раньше, в 2008 году. В этом случае синтетические вирусы также оказались способны размножаться в линиях клеток человека.
Вот и он?Если ученые могут создавать новые вирусы, в том числе потенциально опасные для человека, более того, если они уже экспериментировали с коронавирусом и создавали новые штаммы, то не значит ли это, что штамм, вызвавший нынешнюю пандемию, тоже был изготовлен искусственно?Мог ли SARS-CoV-2 просто "сбежать" из лаборатории, как это случилось с вирусом SARS в 2003 году? Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо разобраться в деталях технологии и понять, как именно делают модифицированные вирусы.Основной метод - это сборка одного вируса из частей нескольких других. Этим способом как раз воспользовалась группа Ральфа Барика (Ralph Baric) и Ши Чжэнли (ZhengLi-Li Shi), создавшая описанную выше химеру из "деталек" вирусов SARS-CoV и SL-SHC01.Если секвенировать геном такого вируса, то можно увидеть блоки, из которых он был построен, - они будут похожи на участки исходных вирусов.Второй вариант - воспроизводить эволюцию в пробирке. Этим путем шли исследователи птичьего гриппа, отбиравшие вирусы, более приспособленные к размножению в хорьках. Несмотря на то, что такой вариант получения новых вирусов возможен, конечный штамм останется близок к исходному.Вызвавший сегодняшнюю пандемию штамм не подходит ни под один из перечисленных вариантов. Во-первых, геном SARS-CoV-2 не обладает такой блочной структурой: отличия от других известных штаммов рассыпаны по всему геному. Это один из признаков естественной эволюции.Во-вторых, никаких вставок, похожих на другие патогенные вирусы, в этом геноме тоже не найдены.Хотя в феврале был опубликован препринт, авторы которого якобы нашли в геноме вируса вставки ВИЧ, при ближайшем рассмотрении выяснилось, что анализ был проведен некорректно: эти участки настолько малы и не специфичны, что с тем же успехом могут принадлежать огромному числу организмов. Кроме того, эти участки можно найти и в геномах "диких" коронавирусов летучих мышей. В итоге препринт был отозван.Если сравнить геном коронавируса-химеры, синтезированного в 2015 году, или двух исходных для него вирусов с геномом пандемического штамма SARS-CoV-2, то окажется, что они отличаются больше, чем на пять тысяч букв-нуклеотидов, - это примерно одна шестая от общей длины генома вируса, и это очень большое расхождение.Поэтому оснований считать, что современный SARS-CoV-2 - это версия синтетического вируса 2015 года, нет.Построчное сравнение участка последовательности S-белка четырех вирусов: двух штаммов из работы 2015 года (MA15 и SHC014-CoV), RaTG13 из летучих мышей и SARS-CoV-2.
Дикие родственникиСравнение геномов коронавирусов показало, что самый близкий известный родственник SARS-CoV-2 - это коронавирус RaTG13, найденный у летучей мыши - подковоноса Rhinolophus affinis из провинции Юннань в 2013 году. У них совпадают 96 процентов генома.Это больше чем у остальных, но, тем не менее, нельзя назвать RaTG13 очень близким родственником SARS-CoV-2 и утверждать, что один штамм превратили в другой в лаборатории.Если сравнить SARS-CoV, вызвавший эпидемию 2003 года, и его непосредственного предка, - вирус из циветы, то окажется, что их геномы отличаются всего на 202 нуклеотида (0,02 процента). Разница между "диким" и полученным в лаборатории штаммом вируса гриппа меньше десятка мутаций.На этом фоне дистанция между SARS-CoV-2 и RaTG13 огромная - более 1100 рассыпанных по всему геному мутаций (3,8 процента).Можно предположить что вирус очень долго эволюционировал внутри лаборатории и приобрел столько мутаций за много лет. В этом случае действительно будет невозможно отличить лабораторный вирус от дикого, поскольку они развивались по одним и тем же законам. Но вероятность появления такого вируса крайне мала.При хранении вирусы стараются держать в покое - именно для того, чтобы они сохранялись в первозданном виде, а результаты экспериментов над ними фиксируются в регулярно появляющихся публикациях Уханьской лаборатории Ши Чжэнли.Гораздо больше шансов найти прямого предка этого вируса не в лаборатории, а среди коронавирусов летучих мышей и потенциальных промежуточных хозяев. Как уже упоминалось, в районе Уханя уже обнаруживались циветы - носители потенциально опасных вирусов, есть и другие возможные переносчики. Их вирусы разнообразны, но скудно представлены в базах данных.Узнав о них больше, мы, скорее всего, сможем лучше понять, как вирус попал к нам. Судя по генеалогическому дереву геномов, все известные SARS-CoV-2 - это потомки одного вируса, жившего примерно в ноябре 2019 года. Но где именно жили его близкие предки до первых случаев COVID-19, мы не знаем.
Два особых участкаНесмотря на то, что отличия от других известных коронавирусов рассыпаны по всему геному SARS-CoV-2, исследователи пришли к выводу, что ключевые для заражения человека мутации сконцентрированы в двух участках гена, кодирующего S-белок. Эти два участка тоже имеют природное происхождение.Первый из них отвечает за правильное связывание с рецептором ACE2. Из шести ключевых аминокислот на этом участке у родственных вирусных штаммов совпадает не больше половины, а у самого близкого родственника RaTG13 - только одна. Патогенность для человека штамма с таким сочетанием описана впервые, а идентичное сочетание нашлось пока только в последовательности коронавируса панголина.Сравнение аминокислот на участке S-белка, отвечающего за взаимодействие с рецептором ACE2 у коронавирусов (штаммов эпидемий 2003 и 2019 года, вирусов из летучих мышей и панголина). Рамками выделены ключевые позиции аминокислот, определяющие специфичность к разным хозяевам.
Как было описано выше, последовательности S-белков, способных связываться с рецепторами ACE2, известны давно, и искусственное "улучшение" вируса при помощи именно этой неизвестной ранее последовательности аминокислот - к тому же не оптимальной - кажется маловероятным.Вторая особенность S-белка SARS-CoV-2 (помимо тех шести аминокислот) - это способ его разрезания. Чтобы вирус попал в клетку, S-белок должен быть разрезан в определенном месте ферментами клетки. У всех остальных родственников, включая вирусы летучих мышей, панголинов и людей, место разреза представляет собой всего одну аминокислоту, тогда как у SARS-CoV-2 - сразу четыре.A - сравнение аминокислот на участке S-белка, отвечающего за связывание с рецептором ACE2. На рисунке видны коронавирусов эпидемий 2003 и 2019 года, коронавирусов из летучих мышей и панголина.
